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接下來為你講解ELISA檢測流程之夾心法

發(fā)布時間： 2022-06-25　　點擊次數(shù)： 3389次

　　ELISA檢測樣本包括血清、血漿、尿液、胸腹水、灌洗液、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等標本,靈敏度*。在收集標本前都必須有一個完整的計劃,必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。我們提倡新鮮標本盡早檢測,對收集后當天就進行檢測的標本,及時儲存在49C備用,如有特殊原因需要周期收集標本，請造模取材后,將標本及時分裝后放在20℃或70°C條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差,蛋白極易降解,直接影響實驗質量,所以避免反復凍融。
　　ELISA檢測之夾心法：
　　1、加樣：將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100μL(若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。給酶標板覆膜，37℃孵育90分鐘。提示：加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產生氣泡。加樣時間宜控制在10分鐘內。
　　2、s物素化抗體/抗原：棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中立即加入物素化抗體/抗原工作液100μL，混勻，酶標板加上覆膜，37℃孵育1小時。
　　3、洗滌：甩盡孔內液體，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。重復此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機。每一步洗滌充分是實驗的根本。
　　4、HRP酶結合物：每孔加酶結合物工作液100μL，混勻，加上覆膜，37℃孵育30分鐘。
　　5、洗滌：棄去孔內液體，洗板5次，方法同步驟3。
　　6、底物：每孔加底物溶液(TMB)90μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長孵育時間，但不可超過30分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止。
　　7、終止：每孔加終止液50μL，終止反應。提示：終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。
　　8、讀值：立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀預熱，設置好檢測程序。
　　9、實驗完畢后，將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質期。

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